根据2.1薄层色谱鉴别条件，薄层别槐建立槐枝的色谱色谱薄层色谱鉴别方法：称取槐枝粉末（过二号筛）2g，加入石油醚（30～60℃）30mL超声处理20min，法鉴法测过滤，枝及中芦弃去滤液，高效滤渣挥干溶剂后，液相加入50mL甲醇超声处理（500W，定其丁含频率40kHz）30min，薄层别槐过滤，色谱色谱取滤液蒸干，法鉴法测加入2mL甲醇溶解残渣，枝及中芦即为供试品溶液。高效按1.2.1方法制备对照品溶液。液相按照薄层色谱法（2020年版《中国药典：四部》 通则 0502）试验方法，定其丁含分别吸取供试品溶液和对照品溶液各2μL，薄层别槐分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（体积比为8∶1∶1∶1）溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置于紫外光灯（365nm）下检视，结果如图2所示。由图2可以看出，供试品色谱图在与对照品色谱图相应位置上，呈现相同颜色的荧光斑点。
分别精密吸取1.3.2中的对照品溶液和1.3.3中的供试品溶液，各10μL，按1.3.1色谱条件测定，理论板数按芦丁色谱峰计不低于3000，系统适应性试验符合要求。对照品溶液、供试品溶液色谱图如图3所示。
选择编号为1＃的槐枝样品粉末，分别选择甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液及50%乙醇溶液4种提取溶剂对芦丁进行提取，考察不同提取溶剂的提取效果。结果发现以50%甲醇溶液为提取溶剂时，色谱峰面积最大，基线平稳，故采用50%甲醇为提取溶剂。以50%甲醇溶液为提取溶剂，分别采用超声法（30、60min）、回流法（30、60min）对芦丁进行提取，考察不同提取方法的提取效果。结果发现超声提取（30、60min）及回流提取（30、60min）的色谱峰面积无明显差异，故选用超声法（30min）对样品进行提取。
分别选用瑞典Nouryon的Kromasil100–5–C18(250mm×4.6mm，5.0μm)色谱柱、岛津企业管理（中国）有限公司的VP–ODSC18(250mm×4.6mm，5.0μm)色谱柱及美国安捷伦科技有限公司的AgilentZorbaxSBC18(250mm×4.6mm，5.0μm)色谱柱进行试验，发现不同色谱柱之间无明显差异，均能实现色谱分离，理论板数，分离度及拖尾因子均符合《中国药典》2020年版的规定。本实验选用瑞典Nouryon的Kromasil100–5–C18(250mm×4.6mm，5.0μm)色谱柱作为分离柱。
在1.3.1色谱条件下，分别考察了甲醇–0.01mol/L乙酸铵(体积比为47∶53)溶液、甲醇–1%冰醋酸（体积比为32∶68）溶液、乙腈–2.5%冰醋酸（体积比为13∶87）溶液3种流动相系统。结果发现采用乙腈–2.5%冰醋酸溶液作为流动相时，色谱图中的溶剂峰明显；采用甲醇–0.01mol/L乙酸铵溶液、甲醇–1%冰醋酸溶液作为流动相时，芦丁的色谱峰尖锐，理论板数高，分离度良好。由于甲醇–0.01mol/L乙酸铵溶液配制较复杂，使用盐溶液操作不当容易阻塞色谱柱，损坏高效液相色谱仪，而甲醇–1%冰醋酸溶液配制简单，操作容易。综合考虑，选择甲醇–1%冰醋酸（体积比为32∶68）溶液为流动相。
自动进样器分别精密吸取1.3.2中的对照品溶液3、7、10、13、15μL注入液相色谱仪，在1.3.1色谱条件下，依次进样测定，以芦丁的质量为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。
用甲醇将对照品溶液稀释10倍，然后逐级稀释进样分析，以3倍信号和噪音的比值（S/N）对应的质量作为方法检出限，5倍信噪比对应的质量作为定量限。芦丁的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表1。
选择1号槐枝样品粉末（过二号筛），精密称取约0.5g，按照1.3.3方法制备供试品溶液，在1.3.1色谱条件下，分别于制备完成后第0、1、2、3、5、7、10、12、24h进样测定，结果见表2。由表2可知，在24h内色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.19%，表明样品溶液在24h内稳定性较好。
取1号槐枝样品粉末（过二号筛）6份，每份约0.5g，精密称定，按照1.3.3方法制备供试品溶液，在1.3.1色谱条件下分别进样测定，结果见表3。由表3可知，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为1.6%，表明该方法精密度较好，满足测定要求。
精密称取1号槐枝样品粉末（过二号筛）6份，每份约0.25g，分别加入质量浓度为7.54μg/mL的芦丁对照品溶液20mL，再精密加入25mL水和5mL甲醇，密塞，称量并记录溶液质量，超声处理（500W，频率40kHz）30min，冷却，再次称量溶液质量，用50%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，在1.3.1色谱条件下分别进样测定，结果见表4。由表4可知，样品加标回收率为98.7%～102.2%，测定结果的相对标准偏差为1.4%，表明该方法准确度较高。
分别精密称取1～10号槐枝样品粉末（过二号筛），各约0.5g，按1.3.3方法制备供试品溶液，在1.3.1色谱条件下分别进样测定，结果见表5。
由表5可知，10批槐枝样品中芦丁的质量分数在0.10%～0.16%之间。不同槐枝样品之间芦丁含量差异较大，可能是在槐枝采集过程中，存在以老枝掺入嫩枝入药的情形，而老枝中芦丁的含量较低。
样品先加石油醚（30～60℃）脱色，然后用甲醇进行提取，以乙酸乙酯–甲醇–甲酸–水（体积比为8∶1∶1∶1）为展开剂，显色后斑点清晰，分离度好，可用于槐枝的定性鉴别。采用50%甲醇作为提取溶剂，以甲醇–1%冰醋酸溶液（体积比为32∶68）为流动相，建立了高效液相色谱法测定槐枝中芦丁含量的方法。该方法简便易行、准确可靠，可为槐枝质量控制提供技术支持。
相关链接：乙酸乙酯，石油醚，芦丁，冰醋酸
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